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Condurre una diagnosi tempestiva di tubercolosi, su campioni respiratori ed extrapolmonari, è di cruciale importanza per le sue implicazioni epidemiologiche, terapeutiche e di Sanità Pubblica. Quando esiste un sospetto clinico di infezione da M.tuberculosis, la diagnosi di laboratorio rapida e affidabile è una necessità, non soltanto clinica, a beneficio del paziente, ma anche epidemiologica, a vantaggio dell’intera comunità. La possibilità di validare in breve tempo la diagnosi, conoscendo la specie e la sensibilità farmacologica dei micobatteri isolati, permette di istituire una terapia tempestiva e specifica, nonché di porre in atto le misure di contenimento della diffusione della malattia. I laboratori di micobatteriologia clinica svolgono un ruolo centrale nella lotta alla malattia; il loro contributo consiste essenzialmente nella ricerca e nell’isolamento dei micobatteri, nella loro identificazione a livello di specie, nonché nella determinazione della sensibilità del ceppo isolato ai chemioterapici. Poiché la diagnosi microbiologica di tubercolosi richiede, in genere, metodi e reagenti specifici di uso non routinario, nonché più tempo e maggiori requisiti di biosicurezza rispetto alla comune diagnostica batteriologica, soltanto i laboratori di microbiologia clinica con sufficiente volume di esami microbiologici possono mantenere nel tempo un’adeguata competenza nella diagnosi micobatteriologica. Questo è particolarmente importante in un paese a bassa incidenza di malattie tubercolari come I’Italia (<10 casi/100.000 abitanti).
Raccolta dei campioni per la ricerca dei micobatteri
La ricerca dei micobatteri può essere effettuata su qualsiasi tipo di materiale biologico (Escreato, Espettorato indotto, Aspirato gastrico, Broncoaspirati e lavaggi bronco alveolari, Urine, Sangue, Liquor, Tessuti ed altri liquidi corporei, Feci) e permette, in caso di reperimento di Mycobacterium tuberculosis complex, di fare diagnosi di tubercolosi.
Il significato del ritrovamento di micobatteri non tubercolari deve essere attentamente valutato alla luce della clinica potendo costituire una semplice contaminazione, una colonizzazione o, più raramente, una micobatteriosi vera e propria. I campioni dovrebbero essere processati entro poche ore dal momento del loro arrivo in laboratorio; la conservazione è tuttavia possibile a +4°C per un massimo di 2 giorni, periodo per il quale è preservata la vitalità dei micobatteri. Fanno eccezione le emocolture che vanno conservate a temperatura ambiente.
La diagnostica di Laboratorio della tubercolosi si basa ancora oggi, fondamentalmente, sull’esecuzione di alcune semplici indagini di microbiologia simili a quelle che venivano effettuate nel secolo scorso agli albori della malattia, vale a dire la ricerca diretta di Mycobacterium tuberculosis nel campione con una colorazione e la sua identificazione in specifici terreni di coltura.
Esame microscopico
L’esame batterioscopico per la ricerca dei Micobatteri ed in particolare del M.tuberculosis permette di monitorare l’efficacia della terapia; la determinazione del numero di Micobatteri nel campione esaminato, durante il trattamento terapeutico, fornisce un precoce ed obiettivo riscontro della risposta al trattamento. Le colorazioni adottate per l’esame microscopico, in Micobatteriologia, sfruttano l’acido-alcol resistenza, proprietà distintiva dei Micobatteri, che permette di appurare, con un ampio margine di sicurezza, se i microrganismi evidenziati in un campione clinico appartengano o no al genere Mycobacterium. I Micobatteri possiedono una parete cellulare ricca di acidi grassi a catena lunga, gli acidi micolici; tale caratteristica li differenzia dagli altri microrganismi e rende ragione dell’acido-alcol resistenza. (l’elevato contenuto lipidico rende difficoltosa la penetrazione dei coloranti nella parete batterica, ma una volta avvenuta, il colorante resta “intrappolato”, legandosi stabilmente agli acidi micolici e non viene più rilasciato neanche in seguito ad energici trattamenti di decolorazione con alcol e acidi). Le colorazioni alcool-acido resistenti generalmente utilizzate nei laboratori di micobatteriologia sono la colorazione di Ziehl-Neelsen, la colorazione a freddo di Kinyoun e la colorazione in fluorescenza con Auramina e Rodamina. Tutte sfruttano la proprietà dell’acido-alcool resistenza. Per i laboratori aventi una routine giornaliera inferiore ai cinque vetrini la colorazione da eseguire è quella di Ziehl-Neelsen (o in alternativa quella di Kinyoun); per quelli con maggior carico di lavoro è consigliata la colorazione in fluorescenza.
All’osservazione microscopica i bacilli acido-alcol resistenti (BAAR) appaiono come lunghi e sottili bastoncelli, talvolta ricurvi, isolati o più spesso riuniti a gruppetti. Alcuni possono presentare un aspetto bandeggiato con zone scarsamente colorate o del tutto prive di colore. Alcune specie di Micobatteri non tubercolari hanno un aspetto microscopico pleomorfo, che può andare dalle forme coccoidi a quelle allungate.
La colorazione di Ziehl-Neelsen e la colorazione di Kinyoun permettono una ottima definizione della morfologia batterica.
All’esame microscopico, ad un ingrandimento di 1000x ad immersione, i bacilli tubercolari appaiono colorati in rosso con disposizione variabile a singoli elementi o a piccoli gruppi disposti con un aspetto a mazzo di sigari o a palizzata su un fondo bluastro (Figura 1). La colorazione con auramina-rodamina è basata sullo stesso principio delle colorazioni precedenti; il colorante principale è una miscela di auramina-rodamina che penetra nella parete batterica e resiste alla sua eliminazione dopo trattamento con una soluzione mista di acido e alcool. Con questa colorazione il preparato microscopico va osservato in fluorescenza con un filtro a luce blu senza immersione e ad un ingrandimento di 400x. In questo modo si ha un maggior campo microscopico di osservazione e in tali condizioni i bacilli, se presenti, appaiono fluorescenti giallo-arancio in campo oscuro (Figura 2).
Il valore diagnostico dell’esame microscopico diretto va opportunamente valutato sia nel caso di un risultato negativo che positivo. Infatti un esame negativo non ha sempre il valore di una negatività reale del campione, perché potrebbe trattarsi di un campione paucibacillare con una concentrazione di micobatteri per ml molto bassa, inferiore a 104 bacilli per ml, valore considerato soglia per una lettura positiva del campione. Lo stesso vale per il risultato positivo in quanto tale positività non significa necessariamente positività per il bacillo tubercolare. Infatti anche i micobatteri cosiddetti atipici o non tubercolari (MOTT) sono alcool-acido resistenti e quindi, nel caso di loro presenza, la positività microscopica sarebbe una falsa positività per il bacillo tubercolare. Inoltre anche microrganismi quali Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, cisti di Cryptosporidium spp., e Cyclospora mostrano vari gradi di acido-alcol resistenza. Bisogna d’altra parte considerare che con il solo esame microscopico non è possibile valutare la vitalità dei micobatteri osservati; campioni positivi all’esame microscopico, provenienti da pazienti in terapia, possono dare infatti colture negative. (Continua)